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抗黄曲霉的海洋微生物的筛选与鉴定

2019年第7期
秦 香1,李成伟1,汪 浩1,李思琪1,金黎明1,宫小明2(1.大连民族大学生命科学学院,辽宁 大连 116605;2.潍坊出入境检验检疫局,山东 潍坊 261041)
 



摘要从南大西洋沉积物样品中分离、筛选出对黄曲霉具有良好拮抗作用的菌株并进行鉴定。用涂布平板法分离出205株菌株,通过初筛得到6株对白色念珠菌有明显拮抗作用的菌株;用琼脂扩散法复筛,最终得到1株拮抗效果最好的菌株,为2.6.2-1号菌株,其抑菌圈直径为29.05±2.72mm。通过形态学特征、生理生化特征和16S rDNA测序鉴定,证明该菌株为芽孢杆菌(Bacillus)。抑菌谱研究结果表明,2.6.2-1号菌株对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、鼠伤寒沙门氏杆菌、肺炎克雷伯氏菌及鲍曼不动杆菌都有一定的抑制作用,是一株广谱抗菌的海洋微生物。

关键词:海洋微生物;黄曲霉;筛选;鉴定;抑菌谱

  

黄曲霉毒素(Aflatoxin, AFT)是一种毒性很强的真菌毒素,主要由黄曲霉(Aspergillusflavus)、寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)等霉菌产生,目前发现的AFT种类有十几种,包括B1B2M1M2G1G2P1Q1等,其中 AFB1毒性最强、为氰化钾的10倍,93年被WTO列为IA类致癌物质[1-4]。黄曲霉毒素严重影响人类和牲畜的健康,也是我国出口食品的质量壁垒。目前,AFT的防治主要通过化学法、物理法、生物法等,其中,生物防治技术是目前的研究热点[5]

本实验以南大西洋海洋沉积物为研究对象,分离、纯化、筛选出能够拮抗黄曲霉的微生物。

 

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料

海洋沉积物样品由中国大洋生物样品馆提供。样品采集于南大西洋海域。

指示菌:黄曲霉 (Aspergillusflavus, CGMCC3.2890)购自中国普通微生物菌种保藏管理中心,为产毒菌株。大肠杆菌,白色念珠菌,金黄色葡萄球菌,铜绿假单胞菌,副溶血弧菌,肺炎克雷伯氏菌,鼠伤寒沙门氏菌,屎肠球菌,鲍曼不动杆菌为大连民族大学生命科学学院415实验室保藏。

1.1.2 试剂与培养基

聚合酶链式反应(PCR)试剂,大连宝生物。葡萄糖、琼脂、胰蛋白胨、酵母浸粉,青岛奥博星。其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3  仪器与设备

S-4800型扫描电子显微镜(日本Hitachi公司);MLS-3020型湿热高压灭菌器(SANYO);BUCHI Rota vapor R-200型旋转蒸发仪(上海精宏试验设备有限公司)

1.2 实验方法

1.2.1 南大西洋微生物的分离和纯化

按照张静楠等[6]的方法分离南大西洋微生物菌株。

1.2.2 拮抗黄曲霉海洋微生物的筛选

将黄曲霉菌株接种到PDA斜面,28条件下培养6 d后加入4 mL 0.9%的灭菌生理盐水,充分震荡后滤掉菌丝,调整孢子浓度为1×107/mL,待用。

100μL制备好的孢子液均匀涂布于PDA平板上,将1.2.1中分离纯化得到的的菌株点种到平板,28条件下培养48 h,进行初筛。采用滤纸片扩散法进行复筛。

1.2.3 菌株的鉴定

1)生理生化鉴定

观察菌落形态。参考《常见细菌系统鉴定手册》、《伯杰细菌鉴定手册》进行形态和生理生化鉴定。

2)基于16S rDNA基因的分子生物学鉴定

将筛选出的菌株培养36 h,提取 DNAPCR反应的条件参考金黎明等[2]

PCR扩增后的产物送到大连宝生物公司进行测序,在GenBank中将测序结果通过BLAST进行比对,构建菌株的系统发育树,并确定该菌株的分类地位。

1.2.4 抑菌谱的测定

参考金黎明等[2]的方法对9种病原微生物进行抑菌谱的测定。

 

2 结果与分析

2.1 海洋微生物分离、筛选和纯化结果

从南大西洋海洋沉积物样品中分离、筛选得到205个单菌落。

2.2 初筛和复筛结果

经对峙培养,筛选出6株对黄曲霉有抑制性的菌株。其中,2.6.2-1号菌株的抑菌效果最好,抑菌直径达29.05±2.72mm

2.2.3 菌株的鉴定结果

2.6.2-1号菌株在平板上显示微隆起的圆形菌落,颜色呈黄白色,无褶皱。革兰氏染色结果为阳性。菌株生理生化鉴定结果如表1所示。

根据供试菌株16S rDNA序列构建的系统发育树如图1,可以看出,2.6.2-1号菌株与标准菌株Bacillusamyloliquefaciens聚到一起,被鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)

1 2.6.2-1号菌株的生理生化鉴定结果

特征

结果

特征

结果

革兰氏染色

+

吲哚实验

-

柠檬酸盐实验

+

甲基红实验

-

硝酸盐实验

+

H2S产生实验

-

V-P实验

+

尿素实验

-

淀粉水解实验

+

明胶液化实验

+

接触酶实验

+

葡萄糖产气实验

+

注:“+”阳性;“-”阴性。

 

1 基于16S rDNA序列构建的2.6.2-1号菌株系统发育树

2.2.4 抑菌谱测定结果

抑菌谱测定结果如表2所示(注:打孔器直径9 mm,抑菌圈>9 mm认为具有抑菌活性)。2.6.2-1号菌株对大肠杆菌,鼠伤寒沙门氏杆菌,铜绿假单胞菌,鲍曼不动杆菌,肺炎克雷伯氏菌都有一定的抑制作用,是一株广谱抗菌的海洋细菌。

2 2.6.2-1号菌株抑菌谱测定结果

病原菌菌种

抑菌直径(mm

金黄色葡萄球菌

大肠杆菌

16.06±0.45

白色念珠菌

副溶血弧菌

鼠伤寒沙门氏杆菌

14.54±0.76

铜绿假单胞菌

18.04±0.37

屎肠球菌

肺炎克雷伯氏菌

14.78±0.84

鲍曼不动杆菌

15.04±0.41

注:打孔器直径为9mm

 

3 结论

本实验以南大西洋海洋沉积物为研究对象,分离、筛选出1株对黄曲霉具有拮抗作用的微生物,2.6.2-1号菌株,抑菌圈直径达29.05mm,经鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。它对大肠杆菌,鼠伤寒沙门氏杆菌,铜绿假单胞菌,鲍曼不动杆菌肺炎克雷伯氏菌都表现出一定的拮抗作用,显示出其广谱抗菌性。

据联合国粮农组织(FAO)估计,每年全世界粮食由于霉菌毒素污染所造成的经济损失可达数千亿美元。中国是粮食生产的大国,但是对防治黄曲霉毒素的生物控制剂产品的研究起步晚,成型的成果少。本实验筛选出的2.6.2-1号菌株,表现出对黄曲霉的拮抗作用,有待于进一步的应用方面的研究。

 

参考文献

[1]Klingelhöfer, D., Zhu, Y., Braun, M., et al.Aflatoxin-publication analysis of a global health treat[J].Food Control, 2018,89,280-290.

[2]金黎明,权春善,赵晶,.一株拮抗黄曲霉的海洋微生物的筛选与鉴定.大连民族大学学报,2019,21(1):29-32.

[3]王威,谢岩黎.降解黄曲霉毒素B1菌株发酵工艺的研究[J].河南工业大学学报(自然科学版),2018,39(3):76-82.

[4]张舒月,郑婧萱,郭晓军,.青贮用拮抗黄曲霉并降解黄曲霉毒素菌株的筛选与鉴定[J].中国饲料,2018(3):26-29.

[5]宫小明,马荣桧,孙军,.黄曲霉毒素生物防控菌的筛选及鉴定[J].微生物学杂志,2015,35(2):103-108.

[6]张静楠,聂灿玉,赵胜楠,.抗白色念珠菌的海洋微生物的分离与鉴定[J].天津农业科学,2016,22(1):79-81.


 第一作者:秦香(1998),女,贵州六盘水人,大连民族大学生命科学学院生物工程系本科生。

通信作者:金黎明(1979),女,黑龙江牡丹江人,副教授,博士研究方向:海洋微生物

基金项目:国家自然科学基金(21272031);辽宁省自然科学基金指导计划项目(20170540204);中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(wd01191);大连民族大学创新创业训练计划资助项目( 201812026017)




   
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